PLA试剂盒组分与储存条件

每个PLA试剂盒内均配备有必需的探针、连接酶、聚合酶以及缓冲液。这些组分必须严格按照规定的温度标准进行储存：例如，核心试剂，包括PLUS/PLA探针，应当存放在4°C的环境中，而酶类，如连接酶和聚合酶，以及核染色剂，则需置于-20°C的低温条件下保存。封固剂需根据具体应用场合进行挑选，例如，载玻片应使用含有DAPI成分的封固剂，并需在2至8摄氏度的条件下保存；而微孔板则应使用核染色防褪色剂，其储存温度应为负20摄氏度。

样品预处理

在进行实验之前，必须确认载玻片上的细胞或组织样本已经完成了固定、抗原的恢复以及透化等步骤。每个平方厘米的样本区域必须均匀涂覆40微升的反应液，这样做是为了防止因干燥而引起的背景信号增强。同时，载玻片在整个实验过程中都应保持湿润状态，特别是在加入一抗之前这一点尤为重要。

试剂配制步骤

1. 洗涤缓冲液制备将洗涤缓冲液A与B的粉末分别溶解于1000毫升的高纯度水之中，以此制备出1倍浓度的溶液。在使用之前，必须将1倍浓度的缓冲液B进行稀释，稀释比例为1:100，使其达到0.01倍浓度。

2. 封闭与一抗孵育在每个1平方厘米的样品上滴加40微升的封闭液，接着再添加一抗溶液。该一抗溶液必须使用抗体稀释剂进行配置，同时PLUS/PLA探针需按照1比5的比例进行稀释。

连接反应体系

连接酶需现配现用。步骤如下：

将5x连接缓冲液稀释为1x（8μL缓冲液+32μL水）。

取1微升的连接酶，与39微升的1倍浓度缓冲液进行1:40的稀释混合。混合均匀后，迅速将样品加入其中，以防止连接酶活性下降。

扩增反应体系

聚合酶同样需临时配制：

5x扩增缓冲液按1:5稀释（8μL缓冲液+32μL水）。

将1μL的聚合酶与39μL的1x扩增缓冲液进行混合，比例为1:80进行稀释。在每次洗涤操作完成后，应将酶类试剂暂时存放在-20°C的冷冻座中。

洗涤与信号检测

所有洗涤环节均需在常温条件下完成，并需采用70mL或更多量的缓冲液进行温和搅拌。同时，载玻片应置于0.01x的洗涤缓冲液B中浸泡约一分钟，以便有效去除未结合的物质。最后，PLA信号将通过荧光显微镜进行观察，并借助特定滤镜来捕捉荧光团的信号。

数据分析方法

图像分析能够对PLA信号进行量化处理，涉及单个细胞的平均荧光亮度或特定区域内的信号点数量。这些数据有助于对蛋白质之间的相互作用或修饰程度进行评估（可参照示例图3）。

注意事项总结

避免试剂反复冻融，酶类使用后立即放回-20°C。

所有稀释步骤需使用高纯度水，降低背景干扰。